HPLC - Hochleistungsflüssigchromatographie

Andere Bezeichnungen:

• High Performance Liquid Chromatography
• High Pressure Liquid Chromatography

 

Was ist Chromatographie?

Als Chromatographie wird die Trennung von Substanzgemischen durch physikalische und chemische Wechselwirkungen bezeichnet. Die Trennung findet durch die Verteilung der einzelnen Substanzen zwischen einer festen (stationären) Phase und einer flüssigen (mobilen) Phase statt. Die stationäre Phase ist fest an einen Träger gebunden, während die mobile Phase in einer Richtung die Analyten von der stationären Phase löst.

 

Was ist "High Performance Liquid Chromatography"?

HPLC ist eine Weiterentwicklung der klassischen Flüssigchromatographie und hat sich in den vergangenen Jahrzehnten zu einer effizienten Analysenmethode entwickelt. Diese Weiterentwicklung wurde durch die Einführung kleiner Partikel (< 10 µm) und die technische Kontrollierbarkeit von hohen Drücken (100–500 bar) ermöglicht. Durch die moderne HPLC können anorganische und organische Ionen, organische neutrale Stoffe, Metallkomplexe und Polymere getrennt und analysiert werden. Dieses nahezu universell einsetzbare Analysensystem hat sich in der Umweltanalytik, Pharmazie, Lebensmittelchemie, Biochemie und vielen anderen Bereichen unentbehrlich gemacht. Die HPLC ergänzt das Analytenspektrum des gaschromatographischen Spektrums um die schwerflüchtigen, flüssigen Analyten.

 

Wie sieht eine stationäre Phase in der Flüssigchromatographie aus?

• feste Phase (Sorbent)
• Trennflüssigkeit auf Packungsmaterial aufgebracht (Hierbei kann auch der Träger zur Trennung beitragen!)
• Gel, Kieselgel oder synthetisches Polymer

 

Welche Art der Chromatographie wird in der HPLC genutzt?

In der modernen HPLC finden die verschiedensten Arten von chromatographischen Trennungsmethoden ihre Anwendung. Diese Variation ermöglicht das breite Analytenspektrum. Angewandte Arten der Wechselwirkungen zwischen Analyt, stationärer und mobiler Phase:

• Adsorptionschromatographie (normal Phase, NP)
• Verteilungschromatographie (reversed Phase, RP)
• Ionenaustauschchromatographie
• Ionenpaarbildungschromatographie
• Ausschlusschromatographie
• Affinitätschromatographie

Adsorptionschromatographie (normal Phase, NP)

Reversible Bindung der Analyten an die stationäre Phase. Hierbei ist die Retentionszeit von der Affinität des Analyten zur stationären Phase sowie von der Fähigkeit der mobilen Phase den Analyten von den Adsorptionsstellen der stationären Phase zu verdrängen.

Verteilungschromatographie (reversed Phase, RP)

Bei der Verteilungschromatographie besteht die stationäre Phase aus einer auf ein Trägermaterial aufgetragenen Flüssigkeit. Die Trennung erfolgt dann durch die unterschiedliche Löslichkeit der Analyten in mobiler und stationärer Phase, meist basierend auf der Polarität. Durch diese unterschiedliche Löslichkeit stellt sich immer wieder ein Verteilungsgleichgewicht zwischen den beiden Phasen ein. Dieses Verteilungsgleichgewicht beeinflusst sehr stark die Elutionszeit (Retentionszeit) des Analyten.

Ionenaustauschchromatographie

Die Trennung beruht hierbei auf der unterschiedlichen Ionengröße und -ladung. Hierbei besteht die stationäre Phase aus einem hochgeladenen Kieselgel oder synthetischen Polymeren mit unterschiedlich geladenen funktionellen Gruppen. Bei Kationenaustauschern werden beispielsweise SO₃²⁻- oder COO⁻-Gruppen verwendet, bei Anionenaustauschern werden quartäre Aminosäuren eingesetzt. Anwendung findet diese Art der Trennung anorganischen Ionen, organischen Säuren, Zucker, Proteine und Peptide und Aminosäuren.

Ausschlusschromatographie (Größenausschlusschromatographie)

Hierbei erfolgt die Trennung der Analyten über die Molekülgröße. Durch die Porengröße des Trägermaterials haben kleiner Moleküle mehr Möglichkeiten eines Irrweges als größere. Kleine Moleküle können in den Poren verweilen, während größere über den direkten Weg aus der Säule gespült werden. So entsteht ein Siebeffekt, auf welchen die Trennung beruht. Anwendungsbeispiele sind organische Säuren, Proteine und Peptide.

Affinitätschromatographie

Bei der Affinitätschromatographie besteht die Trennung auf spezifischen, reversiblen Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase. Hierbei handelt es sich im eigentlichen Sinn nicht um eine chromatographische Trennung, da einzelne Analyten aus dem Gemisch isoliert werden. Angewandt wird diese Form der HPLC meist in der Biochemie.

 

Zu den Wechselwirkungen ist zu sagen, dass normal Phase den Anfang der HPLC-Historie darstellt. Die derzeit am häufigsten eingesetzte Trennmethode ist die Reversed Phase. Ionenaustausch-, Ionenpaarbildung-, Ausschluss- und Affinitätschromatographie finden mehr in speziellen Trennproblematiken ihre Anwendung.

 

Welche Geräte / Bauteile benötigt man für eine HPLC-Analyse?

Ein HPLC-System besteht nahezu immer aus:

1. Eluentenflaschen
2. Entgasereinheit
3. Pumpe
4. Injektor
5. evtl. Vorsäule
6. Trennsäule
7. Detektor
8. Auswerteeinheit (Computer)

 

Anforderungen / Voraussetzungen an die Pumpen?

• Fluss sollte im Bereich von 0.1 mL/min und 10 mL/min regelbar sein
• Der Fluss sollte konstant und pulsationsarm sein
• Druck zwischen 40 und 400 bar
• Diskontinuierliche Verdrängerpumpen (Kolbenpumpe)
• Kontinuierliche Pumpensysteme (Membranpumpe)

 

Gradientensysteme

• Hochdruckgradientensystem
  Die Eluenten werden von 2 separaten Pumpen ins System eingebracht. Die Mischung der Lösemittel erfolgt dann unter Hochdruck.

 

• Niederdruckgradientensystem
  Die Eluenten werden vor der Pumpe gemischt und anschließend in das System eingebracht. Die Mischung der Eluenten erfolgt unter normalen Atmosphärendruck.

 

Was dient als mobile Phase?

Werden Mischungen von Lösemitteln als mobile Phase verwendet, muss vor Beginn der Messungen die Mischbarkeit der Eluate geprüft werden. z. B. Tetrachlormethan / Wasser bildet zwei Phasen.

 

Richtige Wahl des Eluenten

Die Trennung der Komponenten erfolgt bei den meisten Chromatographiearten aufgrund von unterschiedlichen Polaritäten. Bei der HPLC auf der Polarität der stationären und mobilen Phase.

NP: Wird nun als stationäre Phase eine hypophile, polare Kieselgelphase (NP) benutzt, sollte ein unpolares Elutionsmittel gewählt werden. Zu beachten ist bei der Auswahl des Eluenten, dass sich die zu analysierenden Komponenten in diesen löslich sind und polare Molekülbereiche Wechselwirkungen mit der Säule eingehen können. Die Zugabe von polaren Eluenten ermöglicht auch die Analyse von polareren Analyten. Zudem ist zu beachten, dass Wasser als Eluent bei Kieselgelsäulen alle aktiven Stellen dauerhaft belegt und für Kieselgelphasen ungeeignet ist. Mögliche Eluenten sind beispielsweise Hexan, Heptan, Pentan, Dichlormethan und Essigester.

RP: Bei einer unpolaren C18 Phase finden polare Eluenten ihren Einsatz. Meist werden hierbei die Eluenten auch als Mischungen eingesetzt. Der Anteil an organischen Lösemitteln verbessert die Elutionsfähigkeit des Laufmittels. Eingesetzt werden beispielsweise Wasser, Methanol, Ethanol, Aceton und Acetonitril.

 

Aufgabe der mobilen Phase und Anforderung an diese?

Die Aufgabe der Moblien Phase besteht darin, die aufzutrennenden Analyten durch die Säule zu transportieren. Hierbei tritt sie abwechselnd mit der stationären Phase in Wechselwirkung mit den Analyten. Bei polaren stationären Phasen eignen sich daher hydrophile (unpolare) Eluenten besser.

Anforderungen:

• Je nach Detektionsart dürfen die Eluenten keine eigenen Signale erzeugen, d. h., sie dürfen bei einer UV-Detektion keine Eigenabsorption zeigen.
• Für die Flüssigchromatographie sollten hochreine Lösemittel verwendet werden, da Partikel oder enthaltene Verunreinigungen (z. B. Metalle) die Trennung beeinflussen oder die Säule verunreinigen können.
• Eine Entgasung der eingesetzten Eluenten sorgt für ein optimiertes Förderverhalten der Pumpen und verbessern die Detektion. Eine Entgasung ist durch Ultraschallbehandlung im Vakuum, durch eine Inertspülung mit Helium oder durch Filtration durch eine engporige Filtermembran möglich.

 

Einsatzmöglichkeit der Elutionsmittel? (Arbeitsweisen)

Beim Einsatz von Eluenten wird grundsätzlich in zwei Arbeitsweisen unterschieden, isokratischer Eluation und Gradientenelution.

• Isokratische Analyse
  Mobile Phase verändert während der Analyse nicht die Zusammensetzung. Eine isokratische Arbeitsweise ist ausreichend, wenn die zu bestimmenden Analyten ähnliche Wechselwirkungen eingehen und die daraus resultierenden Retentionszeiten nicht zu weit entfernt liegen. Für diese Analyse ist nur eine Pumpe zwingend erforderlich.

• Gradient - programmierte Analyse
  Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase (stufenweise oder kontinuierlich) über die Zeit der Analyse. Durch die Veränderung des Eluenten oder der Mischungsverhältnisse wird das Verteilungsgleichgewicht verschoben und große Retentionszeitdifferenzen können reduziert werden. Diese Arbeitsweise findet oft Anwendung bei der Trennung chromatographisch-unterschiedlicher Komponenten. Technische Voraussetzung hierbei sind jedoch mehrere Pumpen.

 

Probenaufgabe

Prinzipiell werden zwei Arten der Probenaufgabe verwendet:

• Probenaufgabe durch Septuminjektion
  Hierbei wird die Probe mit einer Spritze durch ein Septum in den Eluentenstrom der mobilen Phase aufgegeben. Das, meist aus Silikon bestehende Septum befindet sich in einen Injektionsblock.

• Probenaufgabe über eine Probenschleife (6-Wege-Ventil)
  Laden der Probenschleife:
  Als erster Schritt wird die Probe in die Probenschleife aufgegeben. Hierbei bleiben die Probe und der Eluentenstrom noch voneinander getrennt.
  Injizieren der Probe
  Durch Drehen verändern sich die Wege im Ventil und dadurch wird die Probenschleife zur Seite von Trennsäule und Hochdruckpumpe geöffnet. Hierbei wird dann die Probe mittels der Pumpen im Eluentenstrom auf die Trennsäule überführt.

 

Aufbau der stationären Phasen bei HPLC-Säulen

Normalphasen sind meist polare hypophile Phasen, die aus Kieselgel mit an der Oberfläche freien OH-Gruppen bestehen.

 

Unter RP-Säulen (reversed Phase) werden in der HPLC unpolare lipophile Phasen bezeichnet. Diese bestehen meist aus chemisch modifiziertem Kieselgel. Durch Derivatisierung (Endcapping) mit Alkylchlorsilanen werden die OH-Gruppen neutralisiert. Bei einer RP 18-Phase besteht die Alkylkette aus C18-Ketten.

Um spezielle Trennprobleme zu lösen, wurden RP-Säulen durch Anlagerung von funktionellen Gruppen chemisch verändert. Diese veränderten Phasen werden als Polare gebundene Phasen bezeichnet. Bei diesen Säulen verändern die funktionellen Gruppen, Diol, Cyano oder Amin, die Polarität und damit auch die zugrundeliegende Chromatographie. Bei diesen Phasen erfolgt die Trennung meist durch eine Kombination aus Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch- und Ausschlusschromatographie.

 

Weitere Kennwerte bei HPLC-Säulen

• Wichtige Parameter bei der Säulenauswahl sind Partikeldurchesser, Porengröße, Oberfläche und die funktionelle Gruppe und Dicke der Oberflächenbelegung der Trennsäule.
  Diese Faktoren beeinflussen sehr wesentlich die chromatographischen Eigenschaften einer Säule. Besonders wichtig für die Trennung ist die Hydrophobie und Silanophilie einer stationären Phase, polare Selektivität und Sharp Selektivity.
• Gleichmäßige und sehr kleine Partikel bilden die Grundlage der stationären Phase. Die Partikelgröße ist < 10 µm. Je kleiner die Partikel, desto mehr theoretische Trennstufen sind über die Säulenlänge möglich. So kann durch die Veränderung der Partikelgröße die Trennleistung einer Säule verändert werden.
• Um den Strömungswiderstand der gepackten Säule zu überwinden, ist die technische Beherrschung des benötigten Drucks (bis 400 bar) nötig.
• Besonders häufig finden C18 RP Säulen ihre Anwendung in der HPLC, da hier die Hydrophobie am höchsten ist. Das macht diese Säule besonders für Trennprobleme, bei welchen wässrige Elutionsmittel eingesetzt werden, optimal.
  • Hydrophobie
    Als Hydrophobie wird die Fähigkeit der stationären Phase bezeichnet, polare Analyten möglichst stark zu binden. Die höchste Hydrophobie besitzen C18 Phasen. Im Trend lässt sich grundsätzlich sagen, dass die Hydrophobie mit der Kettenlänge ansteigt bis C18, bei einem weiteren Anstieg der Kettenlänge (z. B. C30) wird nur noch die Belegungsdichte verringert. Das Maximum der Hydrophobie ist in der Stereo – Chemie der stationären Phase begründet.
    
    Die Hydrophobie ist aber auch abhängig von der Oberfläche und Porengröße. Da die Gesamtoberfläche der entscheidende Faktor für die Beeinflussung der Hydrophobie ist, muss der Zusammenhang zuwischen Poren und Porenvolumen.

 

Welche Detektoren werden bei der HPLC eingesetzt?

In der HPLC werden die angeführten Detektionstechniken eingesetzt. Die Wahl des Detektors richtet sich meist nach den zu analysierenden Komponenten. So kann ein elektroanalytischer Detektor nur für elektrochemisch aktive Substanzen eingesetzt werden, und ein RI-Detektor wird meist bei Zuckeranalysen verwendet. Am häufigsten wird der UV/VIS-Detektor in der HPLC-Analytik eingesetzt.

• UV/VIS-Detektor
  Der Detektor kann Komponenten detektieren, die Licht in diesem Bereich adsorbieren. Diese Fähigkeit kann auch durch chemische Veränderungen (Derivatisierung) der Komponenten erreicht werden. In der HPLC unserer Zeit werden mittlerweile verschiedene Arten von UV/VIS-Detektoren eingesetzt:
  • Diionenarraydetektoren
    Der Diionenarray-Detektor ist einer der am häufigsten eingesetzten Detektoren in der HPLC.
  • Spektrometer (variable Einstellungsmöglichkeit der Wellenlängen)
  • Photometer (fest eingestellte Wellenlänge)
• Fluoreszenzdetektor
• Refraktometrischer Detektor (RI)
• Elektroanalytischer Detektor
• Massenselektiver Detektor

 

Funktionsweise

• UV/VIS-Detektor
  Die Detektion erfolgt durch ein einfaches Adsorptionsprinzip. Hierbei wird die Probe über eine Durchflusszelle durch einen Strahl der ausgewählten Wellenlänge geleitet und die Adsorption gemessen. Die angestrebte Messwellenlänge beeinflusst die Wahl des Eluenten, da dieser ab einer bestimmten Minimumwellenlänge die Strahlung selbst adsorbiert. Diese Detektorart ermöglicht die Detektion von Benzolverbindungen und anderen aromatischen Komponenten, Komponenten mit Doppel- oder Mehrfachbindungen und brom- und iodhaltigen Komponenten.

• Diionenarray-Detektor
  Beim Diionenarray-Detektor wird die Probe nicht durch einen Strahl der ausgewählten Wellenlänge geleitet, sondern durch einen Strahl aus polychromatischem Licht geleitet. Anschließend wird dieser polychromatische Lichtstrahl durch ein Prisma in die einzelnen Wellenlängen aufgespalten und jede einzelne Wellenlänge über eine Photodiode detektiert. Diese sind auf einen Array angeordnet. Durch diese Detektion können Verunreinigungen (Co-Elutionen) von Peaks schnell erkannt werden und nicht basisliniengetrennte Peaks detektiert und quantifiziert werden. Dies ist mit normalen UV/VIS-Detektoren nicht möglich.

 

Wichtige Faktoren bei der Wahl der richtigen Säule?

 

Eingesetzte Detektoren in der HPLC

• Differentieller Detektor
  Veränderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase werden detektiert.
• Integrale Detektoren
• Konzentrationsempfindlichen Detektoren
• Massenstromselektiven Detektoren
• Universellen Detektoren
  Jeder eluierende Analyt erhält ein proportionales Signal, basierend auf der Masse.
• Selektiven Detektoren
  Die Empfindlichkeit zwischen verschiedenen Analytgruppen schwankt.
• Spezifische Detektoren
  Nur spezifische Analytgruppen oder einzelne Analyten können detektiert werden.

 

Größenparameter in der LC und deren Berechnung

Packungsmaterial

Wichtig bei der Auswahl und Einschätzung des Packungsmaterials ist der mittlere Teilchendurchmesser der Säule (d_p) und der durchschnittliche Porenradius (r_p). Zudem spielen in der Beurteilung der Trennleistung

• Teilchengrößenverteilung
• Oberfläche
• Porenvolumen
• chemische Zusammensetzung der Oberfläche

eine wichtige Rolle.

 

Säulenvolumen (VC)

Bei der Berechnung des Säulenvolumens wird nur das geometrische Volumen der Trennsäule bestimmt und dadurch das Volumen und Trägermaterial bestimmt.

Volumen ist Grundfläche (A_C) multipliziert mit der Säulenlänge.

 

Grundfläche ist Radius (r_C) zum Quadrat multipliziert mit Pi.

 

Grundfläche ist Durchmesser (d_C) zum Quadrat dividiert durch 4.

 

Durchflussvolumen (V_M)

Das Durchflussvolumen entspricht dem Totvolumen in der Gaschromatographie. Hierbei wird eine inerte Flüssigkeit (mobile Phase) auf die Säule aufgegeben und die Flüssigkeitsmenge zwischen den Packungsteilchen mit der Flüssigkeitsmenge in den Poren addiert. Bestimmt wird diese über die Durchflusszeit t_M.

 

Lineargeschwindigkeit u

Zur Berechnung der Lineargeschwindigkeit einer mobilen Phase wird die Durchflusszeit, der mobilen Phase und die Säulenlänge benötigt.

 

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HPLC – Hochleistungsflüssigchromatographie